بررسی اثر متقابل زمان و غلظت مواد محافظت‌کننده سرما بر انجماد شیشه‌ای تخمک‌های نابالغ گاوی با روش کرایوتاپ

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان
کاوه علیزاده 1
نجمه داودیان 2
علی کدیور 3
ابراهیم احمدی 4
ناصر شمس اسفندآبادی 3
1 دانشجوی دکتری تخصصی رشته فناوری های تولیدمثلی در دامپزشکی، گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد- ایران.
2 دانشگاه شهرکرد
3 گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد- ایران
4 پژوهشکده فناوری جنین دام، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد- ایران.
10.22034/ijvcs.2026.14938.1094
چکیده
این مطالعه با هدف ارزیابی برهم‌کنش زمان و غلظت مواد محافظت‌کننده سرما (CPA) در انجماد شیشه‌ای تخمک‌های نابالغ گاوی انجام شد. در این پژوهش، ۲۱۲ مجموعه تخمک-سلول کومولوس (COC) نابالغ با کیفیت مطلوب در قالب پنج پروتکل متفاوت انجماد شیشه‌ای با روش کرایوتاپ مورد بررسی قرار گرفتند. متغیرهای مستقل شامل غلظت‌های مختلف اتیلن گلیکول (EG) و دی‌متیل سولفوکساید (DMSO) در محیط‌های تعادل (EM) و انجماد (VM) به همراه زمان‌های مواجهه متفاوت (۳۰ ثانیه تا ۳ دقیقه) بود. نتایج ارزیابی مورفولوژیک نشان داد که پروتکل اول (۱ دقیقه EM با ۱۰درصد EG/DMSO و ۳۰ ثانیه VM با 2۰درصد EG/DMSO ) بیشترین درصد تخمک‌های سالم (24/4 ± 34/83) را به همراه داشت، اما هیچ‌یک از تخمک‌ها در درجهC (تخمک زنده و کمتر از نیمی از سلول های کومولوس مرده) قرار نگرفتند. در مقابل، پروتکل چهارم (۲ دقیقه EM با ۱۰درصد EG/DMSO و 45 ثانیه VM با 2۰درصد EG/DMSO) بالاترین درصد درجهC (07/0 ± 18/44) را نشان داد. تحلیل رگرسیون لجستیک نیز تأیید کرد که زمان ۳۰ ثانیه در VM شانس قرارگیری در درجهB (تخمک زنده ولی بیش از نیمی از سلول های کومولوس مرده) را افزایش می‌دهد (001/0P<)، در حالی که افزایش زمان EM به ۲ دقیقه شانس قرارگیری در درجهC را کاهش می‌دهد (001/0P<). نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که موفقیت در انجماد شیشه‌ای تخمک‌های نابالغ گاوی وابسته به تعادل بهینه بین غلظت و زمان مواجهه با ضدیخ هاست و پروتکل چهارم به‌عنوان روش بهینه برای حفظ هم‌زمان مورفولوژی و کیفیت زنده‌مانی معرفی می‌شود.
کلیدواژه‌ها
انجماد شیشه‌ای
تخمک نابالغ گاوی
مواد محافظت‌کننده سرما
زنده‌مانی
موضوعات

عنوان مقاله English

Evaluation of the Interaction between Exposure Time and Cryoprotectants Concentration on the Vitrification of Bovine Immature Oocytes with Cryotop

نویسندگان English

Kaveh Alizadeh 1
Najmeh Davoodian 2
Ali Kadivar 3
Ebrahim Ahmadi 4
Naser Shams Esfandabadi 3
1 PhD Student in Veterinary Reproductive Technologies, Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Shahrekord University, Shahrekord, Iran
3 Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Shahrekord University, Shahrekord, Iran.
4 Research Institute of Animal Embryo Technology, Shahrekord University, Shahrekord, Iran.
چکیده English

This study aimed to evaluate the interaction between exposure time and concentration of cryoprotective agents (CPAs) in the vitrification of bovine immature oocytes. A total of 212 cumulus-oocyte complexes (COCs) with optimal quality were subjected to five different vitrification protocols using the Cryotop method. Independent variables included various concentrations of ethylene glycol (EG) and dimethyl sulfoxide (DMSO) in equilibration (EM) and vitrification (VM) media, along with different exposure times (30 seconds to 3 minutes). Morphological assessment revealed that Protocol 1 (1 min EM with 10% EG/DMSO and 30 sec VM with 20% EG/DMSO) yielded the highest percentage of morphologically intact oocytes (83.34±4.24), though none achieved Grade C quality (live oocyte and <50%dead cumulus cells). In contrast, Protocol 4 (2 minutes EM with 10% EG/DMSO and 45 seconds VM with 20% EG/DMSO) demonstrated the highest Grade C (44.18±0.07). Logistic regression analysis confirmed that 30-second exposure in VM significantly increased the likelihood of Grade B (live oocyte and >50%dead cumulus cells) classification (P<0.001), whereas extending EM time to 2 minutes decreased the probability of Grade C status (P<0.001). These findings indicated that successful vitrification of bovine immature oocytes depends on the optimal balance between CPA concentration and exposure time, with Protocol 4 recommended as the optimal method for simultaneous preservation of morphology and viability.

کلیدواژه‌ها English

Vitrification
Bovine immature oocyte
Cryoprotectant agents
Viability
1.      Arav A. Cryopreservation of immature bovine oocytes: challenges and solutions. Reprod Fertil Devel. 2014; 26(1): 87-93. 
2.      Arav A, Natan Y. Vitrification: from basic science to commercial application in bovine reproduction. Anim Front. 2023; 13(2): 45-53.
3.      Catandi P, B, Dias FCF, Alves BG, Martins L, T, Nishimura TL, Alves KA. Concentration-time interplay in CPA exposure affects mitochondrial activity of GV bovine oocytes. Reprod Fertil Devel. 2024; 36(2): 189-201.
4.      Dinnyes A, Dai Y, Jiang S, Yang X. High developmental rates of vitrified bovine oocytes following parthenogenetic activation, in vitro fertilization, and somatic  cell nuclear transfer. Biol Reprod. 2000; 63(2): 513-518.
5.      Ferré LB, Chitwood JL, Ross PJ. Assisted reproductive technologies in cattle: current status and future perspectives. Animals. 2020; 10(8): 1321.
6.      Ho VNA, Braam SC, Pham TD, Mol BW, Vuong LN. The effectiveness and safety of in vitro maturation of oocytes versus in vitro fertilization in women with a high antral follicle count. Hum Reprod. 2019; 34(5), 1–10.
7.      Kuwayama M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology, 2007; 67(1): 73-80.
8.      Luciano AM, Franciosi F, Modina SC, Lodde V. The mitochondrial life cycle during oocyte maturation and developmental competence in cattle. International J Mol Sci. 2021; 22(9): 4567. 
9.      Lonergan P, Fair T. Lessons from cattle oocytes: implications for in vitro embryo production. Theriogenology. 2016; 86(8): 1874-1882. 
10.  Magnusson V, Feitosa WB, Goissis MD, Yamada C, Tavares LMT, DAvila Assumpcao MEO, Visintin JA. Bovine oocyte vitrification: Effect of ethylene glycol concentrations and meiotic stages. Anim Reprod Sci, 2008; 106(3–4): 265–273.
11.  Morató R, Mogas T. CPA toxicity in bovine oocytes: a review. Anim Reprod Sci. 2022; 241, 106933.
12.  Mara, L, Casu S, Carta A, Dattena M. Cryobanking of farm animal gametes and embryos as a means of conserving livestock genetics. Anim Reprod Sci, 2013; 138:  25–38. 
13.  Papis K, Shimizu M, Izaike Y. Vitrification devices for bovine oocytes: a comparative study. CryoLetters. 2019; 40(2): 123-130.
14.  Ribas IC, Silva CP, Figueiredo RA. Advances and challenges in bovine embryo cryopreservation and transfer. Theriogenology. 2021; 165: 100–110.
15.  Rocha CC, Bhat MH, Leao BC. Oocyte vitrification in cattle: current status and  future perspectives. Animals. 2022; 12(17): 2203.
16.  Sirard, MA. Commercial IVF in cattle: where we are and where we go. Animals. 2023; 13(6): 910. 
17.  Sprícigo JF, Albuquerque LG, Seneda MM. Advances in vitrification devices for bovine oocytes and embryos. Anim Reprod. 2022; 19(1): e20220001. 
18.  Xu X, Hao T, Yang E, Hao H, Du W, HangZhang H. Zhao X. Improvement of Fertilization Capacity and Developmental Ability of Vitrified Bovine Oocytes by JUNO mRNA Microinjection and Cholesterol-Loaded Methyl-β-Cyclodextrin Treatment. Int J Mol Sci. 2023; 24: 590-609. 
19.  Yodrug Th, Parnpia R, Hirao Y, Somfai T. Effect of vitrification at different meiotic stages on epigenetic characteristics of bovine oocytes and subsequently developing embryos. Anim Sci J. 2021; 92(1): e13596.
20.  Zhao XM, Du WH, Wang D, Hao HS, Liu Y, Qin T, Zhu HB. Recovery of mitochondrial function and endogenous antioxidant systems in vitrified bovine oocytes during extended in vitro culture. Mol Reprod Develop. 2011; 78(12): 942–950 
21.  Zhou XL, AlNaib A, Sun DW, Lonergan P. Bovine oocyte vitrification using the Cryotop method: effect of cumulus cells and vitrification protocol on survival and subsequent development. Cryobiology. 2010; 61(2): 173-178.
علوم درمانگاهی دامپزشکی ایران
دوره 19، شماره 2 - شماره پیاپی 33
پاییز و زمستان 1404
اسفند 1404
صفحه 61-69